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M5 Marine Animal DNA Kit

海洋动物基因组提取试剂盒使用说明书

产品名称            单位        货号

M5 Marine Animal DNA Kit      50T      MF119-01

【储存条件】

常温运输，室温（15~30˚C）保存。

【产品简介】

本试剂盒适合于从多种海洋动物（如鱼类、虾类、贝类等）组织中提取总DNA。纯化过程不需苯酚或氯仿等有机溶剂，无需乙醇沉淀。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅胶质离心吸附柱上，其他污染物可流过膜，蛋白、PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步有效的洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。

【产品组份】

50T                                   

Buffer GTL                       15 ml

Buffer GL                        15 ml                   

Buffer GW1 (concentrate)          13 ml 

Buffer GW2 (concentrate)          15 ml                  

Buffer GE                        15 ml

Proteinase K                       1 ml                  

Spin Columns DM              

With Collection Tubes               50                

【自备试剂】

 无水乙醇

【实验准备】

1．样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。

2．第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。

3．使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，Buffer GTL和Buffer GL于56˚C水浴重新溶解。

4．如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GTL后加入4 μl DNase-Free 的RNase A（100 mg/ml）。

【不同海洋动物组织提取得率】

样本           建议孵育时间       DNA 得率

贝类组织            0.5 h           12-20 μg

虾组织               1 h            8-14 μg

鱼组织               1 h            15-40 μg

【操作步骤】

1．取不超过30 mg组织材料，液氮充分研磨后，放入离心管（自备）中，加入200 μl Buffer GTL，涡旋振荡15秒。

注意：1）根据提取的组织不同，起始量也有不同，腮的细胞量较大，一般建议提取量不超过20 mg。

2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl 100 mg/ml 的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。

2．加入20 μl Proteinase K，涡旋混匀，简短离心，使管壁上的溶液收集到管底。56˚C孵育，直至组织完全溶解，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：不同组织裂解时间不同，通常需0.5-2小时即可完成。对于难裂解组织可以适当延长孵育时间。

3．加入200 μl Buffer GL，充分颠倒混匀，70˚C孵育10分钟，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：加入Buffer GL时可能会产生白色沉淀，一般70˚C放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。

4．加入200 μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

5．将步骤4所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm（～13,400×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6．向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

7．向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。

8．12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。

9．将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20˚C保存DNA。

注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。

2）离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。

3）用另外的50-200 μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。

4）如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤9所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤9；若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。

5）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20˚C保存。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。