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M5 HiperScript II Reverse Transcriptase

使用说明书

产品名称                      单位        货号

M5 HiperScript II Reverse Transcriptase   10000U     MF309-01

M5 HiperScript II Reverse Transcriptase   5×10000U   MF309-05

【储存条件】

长期保存，请置于-20˚C，有效期24个月。

【产品简介】

M5 HiperScript II Reverse Transcriptase是基因工程改造后的M-MLV反转录酶(莫洛尼氏鼠白血病病毒pol基因)，降低了RNA酶H活性，增强了热稳定性。该酶可以用来合成cDNA第一链，同传统的M-MLV RT相比，该酶在温度升高（最高可达65°C)时有更好的特异性，cDNA的产量更高。M5 HiperScript II Reverse Transcriptase可合成cDNA的最高长度达12 kb。

【单位定义】

1单位指以poly(A)为模板、oligo(dT)₂₅为引物，在37°C条件下，10分钟内催化1 nmol的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

【产品组分】

                                            MF309-01        MF309-05

M5 HiperScript II Reverse Transcriptase (200U/μl)       50 μl           5x 50 μl

5× M5 HiperScript II RT Buffer                       1000 μl         5x1000 μl

0.1M DTT                                          500 μl          5x500 μl

贮存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 7.5 @ 25°C)，100 mM NaCl，0.1 mM EDTA，1 mM Dithiothreitol (DTT)，0.01% Nonidet ^TM P-40 (NP-40) (V/V)，50%甘油(V/V)。

【适用范围】

合成cDNA第一链，用于RT-PCR和实时RT-qPCR, 用于克隆和表达研究。

制备带标记的cDNA探针，用于microarray研究；DNA标记和引物延伸法分析RNA。

【使用方法】

A．第一链cDNA的合成：(以下20 μl的反应体系可以用于反转录1 ng-5 μg总RNA或1-500 ng mRNA)

1. 将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中:

1 μl  oligo(dT)_12-18(500 μg/mL)或50-250 ng随机引物或2 pmole基因特异性引物

1 ng-5 μg 总RNA或1-500 ng mRNA

1 μl 10 mM dNTP混合物 (dATP，dGTP，dCTP和dTTP均为10 mM)

加入灭菌蒸馏水至12 μl

2. 混合物在65°C加热5分钟后，迅速置于冰上。短暂离心收集组分后，加入：

4 μl  5× M5 HiperScript II RT Buffer

2 μl  0.1 M DTT

1 μl  RNase抑制剂*(40 U/μl)。

*注：RNase抑制剂不随酶附送，需要单独采购。如果起始RNA的量小于50 ng，则必须加入RNase抑制剂。

3. 用枪头反复吸打混匀组分，若使用oligo(dT)_12-18引物，应42°C下孵育2分钟；若使用的是随机引物，应在25°C下孵育5分钟。

4. 加入1 μl M5 HiperScript II Reverse Transcriptase (200U/μl)轻轻上下颠倒混匀。如果您使用的RNA不足1 ng，减少M5 HiperScript II Reverse Transcriptase (200U/μl)添加量至0.25 μl，并加入无菌蒸馏水至终体积为20 μl。

5. 42°C孵育50分钟。

6. 70°C加热15分钟以终止反应。

B．PCR反应体系和程序：

1. 在PCR反应管中加入下列成分：

10× Taq PCR缓冲液                                                5 μl

50mM MgCl₂                                                     1.5 μl

10mM dNTP混合物                                               1.0 μl

上游扩增引物 (10 μM)                                            1.0 μl

下游扩增引物 (10 μM)                                            1.0 μl

Taq DNA聚合酶 (5 U/μl)                                          0.4 μl

2 μl cDNA (来自于第一链合成反应)                                 2.0 μl

灭菌蒸馏水                                                     至50 μl

2. 变性: 94°C加热2分钟。

3. 进行15个到40个PCR循环。退火和延伸条件需要根据Taq DNA聚合酶而设定。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。