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产品名称                             单位        货号

M5 Yeast Plasmid Mini Kit     50T      MF120-01

【储存条件】

在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2 ~ 8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。加入RNase A后的Solution YP1应置于2 ~ 8℃保存，可稳定保存6个月。

【产品简介】

本试剂盒用于酵母高纯度质粒DNA的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低pH处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低盐、高pH条件下洗脱，最后得到高达20 ug纯度较高的质粒DNA。

【产品特色】

快捷、高效：操作简便，得率高，节约时间。

纯度高：沉淀致密，去杂干净。

【产品组份】

注意：使用前将全部RNase A溶液加到Solution YP1中混合均匀，2 ~ 8℃保存;按要求在Buffer WB2中加入无水乙醇

【自备试剂】

山梨醇Buffer：用0.1M磷酸钠缓冲液 (pH7.4) 配制1.2 M山梨醇。

0.1M磷酸钠缓冲液 (pH7.4) 的配制：77.4 ml 0.1 mol/L Na₂HPO₄+ 22.6ml 0.1mol/L NaH₂PO₄；

溶壁酶Lyticase、无水乙醇、RNase A（可选）。

【操作步骤】

取1-5 ml酵母培养物（不超过5×10⁷酵母细胞），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min， 尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

酵母细胞壁的去除：向菌体中加入600 μl山梨醇buffer，加入大约50 U Lyticase，充分混匀。30℃处理30 min。4000 rpm(~1500×g)离心10 min，弃上清，收集沉淀。

注意：以上为5×10⁷细胞Lyticase用量，根据酵母的菌株和酵母细胞的数量不同，所用Lyticase的浓度和处理时间应进行适当调整

加入250 μl Solution YP1（请先检查是否已加入RNase A）重悬沉淀。

注意：以上Lyticase的用量和处理时间为经验值，根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同，所用Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。

加入250 μl Solution YP2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分混匀，室温放置5 min。

注意：温柔混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠。

加入350 μl Solution YP3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，12,000 rpm (~13,400×g )离心10 min。

注意：Solution YP3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

小心地将上清液加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入400 μl Buffer WB1（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉废液。

向吸附柱中加入600 μl Buffer WB2（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

重复操作步骤8。

将吸附柱放入收集管中12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸 附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100 μl Buffer EB，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min收集质粒。

注意：通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或者分光光度计法都很难检测到。通常建议使用1-5 μl 用作PCR模板检测。使用5-10 μl转化大肠杆菌。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。